TTC法检测牛奶中的抗菌药物
黄怡君 姜也文 胡松华1
（浙江大学动物科学学院动物医学系，杭州 310029）
摘要：针对用TTC法检测牛奶抗菌药物残留过程中因为在被检乳样中加入指示菌的数量不稳定而影响检测的问题，本研究增设了菌液稀释度试验以确定加入的菌液量。同时，采用TTC法对奶牛场常用的几种抗菌药物检测其乳中最低检测浓度。结果是青霉素3μg/kg，链霉素660μg/kg，庆大霉素620μg/kg，卡那霉素6200μg/kg，红霉素30μg/kg，环丙沙星500μg/kg，土霉素100μg/kg，金霉素100μg/kg，磺胺嘧啶100μg/kg。本研究用TTC法对青霉素、红霉素、土霉素、金霉素和磺胺嘧啶的检测灵敏度均达到农业部规定的牛乳中兽药残留最高限量要求。TTC法具有简便、价廉的优点，并且所检测的抗菌素范围较广，符合我国奶牛场中使用抗菌药物种类较多的现状。
关键词：牛奶；TTC；抗菌物；抗生素；残留
Determination of Antibacterial Drug’s Residues in Bovine Milk with a TTC Test
Yijun Huang Yewen Jiang Songhua Hu
(Department of Veterinary Medicine, College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310029)
Abstract: In determination of antibacterial drug’s residues in milk, the result is often influenced by the number of indicator bacteria added into a milk sample when a TTC test is used. Therefore, a test for determination of the number of indicator bacteria was proposed before a TTC test was carried out. This study was designed to determine the minimum concentration of 9 common antibacterial drugs in bovine milk detectable by the TTC test. The results indicated that the limits for detection of penicillin, streptomycin, gentamicin, kanamycin, erythromycin, ciprofloxacin, oxytetracycline, aureomycin and sulfadiazine were 3μg/kg, 660μg/kg, 620μg/kg, 6200μg/kg,30μg/kg, 500μg/kg,100μg/kg,100μg/kg and 100μg/kg, respectively. The detectable limits for penicillin, erythromycin, oxytetracycline, aureomycin and sulfadiazine were equal to or bellow the Minimum Residue Limit Standards set by the Ministry of Agriculture of China. As the TTC test was simple and cheap with a broad spectrum of drugs detectable, it is suitable for the current status of dairy farms where various antibacterial drugs are used for disease control.
1 通讯作者。浙江省重点科技攻关项目。电话：0571-86971852；传真：0571-86971491；电子邮箱：songhua@zju.edu.cn
Keywords: Milk; TTC; Antibacterial drugs; Antibiotic; Residues
抗菌药物在奶牛养殖场被广泛应用于治疗各种感染性疾病，容易造成牛奶中的药物残留。随着生活水平的提高，人们越来越关注自身的健康，牛奶中的抗菌药物残留问题也日益受到社会的重视。牛奶中残留的抗菌药物主要是抗生素，它对饮用者的潜在危害包括产生过敏反应，引起细菌耐药性，导致人体肠道内菌群失调等[1]，并对生鲜乳的后续加工产生不利影响[2，3，4，5]。为了控制牛奶中的药物残留，世界许多国家作了相应的规定，如欧盟国家卫生和健康部门规定了牛乳中青霉素类药物残留的最高限量为4～30μg/kg，四环素的残留限量为100μg /kg；联合国粮农组织(FAO)和联合国世界卫生组织(WHO)共同创建的FAO/WHO食品法典委员会(CAC)也规定了各类常用兽药在牛奶中的残留限量，如苄青霉素限量为4μg /kg，头孢噻呋最高残留限量为100μg/kg[9]。我国在2001年9月由农业部发布的《无公害食品－生鲜牛乳》明确规定“抗生素不得检出”[8]；2002年12月又发布了《动物性食品中兽药最高残留限量》，其中对牛乳中的兽药残留限量作了明确规定[10]。
牛奶中抗菌药物残留的检测方法主要有微生物学、理化学和免疫学检测法。理化学检测法要求复杂昂贵的仪器和设备，一般只适用于实验室检测。目前我国生产管理上常用的抗菌药物残留快速检测方法主要有TTC法和Snap法。Snap法是利用免疫学原理采用ELISA法进行检测，具有特异性高的优点，但不同的抗生素需要用不同的试剂盒来检测。我国目前主要是针对β－内酰胺类抗生素进行检测。由于Snap法需要用到进口试剂，对一个奶样检测一种抗生素的费用为50元左右，对许多奶农来说是一个负担。TTC法是一种微生物学方法，其原理是嗜热链球菌(S.thermophilus)在牛乳中生长时会将无色的2，3，5－氯化三苯基四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium Chloride，TTC）还原为红色的三苯甲瓒，而当牛奶中存在抗生素等抗菌物质时，会抑制嗜热链球菌的生长，TTC则无法被还原。TTC法具有广谱、价廉的优点，已列入国家标准[11]。但是在采用该法检测牛奶中残留药物的具体操作过程中，我们发现加入检测牛奶中的嗜热链球菌的数量会对检测结果产生影响。若加入的量过多，会产生假阴性结果，若加入的量过少，则细菌在对照奶样和待测奶样中不会使TTC明显变色。因此，本研究在应用TTC法时，增设了细菌稀释度的试验，以确定检测乳样中所加入的合适的细菌数量，达到了国家标准规定的灵敏度要求。
一材料和方法
1.材料
青霉素钾、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、红霉素、环丙沙星、土霉素、金霉素、磺胺嘧啶标准品，由中国药品生物制品检定所提供；嗜热链球菌(S.thermophilus)，由杭州微生物研究所提供；2，3，5－氯化三苯基四氮唑（TTC），国药集团化学试剂有限公司所提供；不含有抗生素的健康鲜牛奶，由杭州美丽健乳品有限公司提供。Snap仪和试剂盒（New SNAP Beta-Lactam Test Kit），IDEXX Laboratories提供。
2.TTC法
首先，将无抗健康鲜牛乳以2000rpm的转速离心15min，去除上层脂肪，113℃灭菌15min，待用。然后，确定被测奶样中需要加入嗜热链球菌的量。将嗜热链球菌冻干粉接种于脱脂牛乳中，36℃培养18小时后，菌液接种至灭菌脱脂乳，再经36℃培养15小时。用灭菌脱脂乳以1：10、1：20、1：40、1：80的比例稀释菌液，待用。取10mm×150mm试管，每管加入无抗奶9ml，80℃水浴加热5min后，冷却到37℃以下。加入1ml上述用灭菌脱脂乳稀释好的菌液，在36℃水浴中培养2小时。然后加入4％TTC溶液0.3ml，继续水浴培养30分钟后观察结果。以显色为微红色的试管相对应的菌液稀释度作为以下试验用稀释度。
为测定本实验条件下TTC法检测的最低药物浓度，将各抗菌药物用无抗牛乳配制成三种不同浓度（表1）。在试管中加入9ml含抗生素的牛奶，对照管牛奶不含抗生素，80℃水浴5分钟，随后冷却到37℃以下。各加入1ml菌液（稀释度由上述试验确定），36℃水浴2小时。然后加入4％TTC溶液0.3ml，继续水浴，每隔15分钟观察一次结果。若待测牛奶的颜色比对照乳液颜色浅，则判定为阳性。每种药物阳性结果中对应的最低含量，即为该药物的最低检出量。每种药物重复测定3次。
表1 牛奶中各种抗菌药物的浓度（μg/kg）
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药物
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牛奶中药物浓度
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青霉素
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2
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3
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4
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链霉素
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330
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660
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1300
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庆大霉素
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310
|
620
|
1200
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卡那霉素
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3100
|
6200
|
13000
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磺胺嘧啶
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60
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80
|
100
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红霉素
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20
|
30
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40
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环丙沙星
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400
|
500
|
600
|
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土霉素
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50
|
100
|
200
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金霉素
|
50
|
100
|
200
|
2. Snap法
根据Snap试剂盒操作说明书进行。加乳样于样品管中，摇匀，加热样品管和检测板5分钟后，将样品加于检测板上的样品孔中，当激活圆环开始退却时，按SNAP键，反应4min后由读数仪读取并打印结果。检测读数小于1.05时判为阴性，大于1.05时判为阳性。
二结果与分析
本研究用TTC法检测到的各类抗菌药物最低检出量以及农业部2002年12月发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》所规定的有关抗菌药物在牛奶中允许的最高残留限量见表2。比较结果表明，对于牛奶中的残留的青霉素、磺胺嘧啶、红霉素、土霉素和金霉素进行检测，TTC法的灵敏度可以达到农业部的检测要求；对链霉素和庆大霉素的检测，TTC法的灵敏度还不够；卡那霉素和环丙沙星的残留限量则未在农业部规定中列出。
表2 TTC法检测牛奶最低药物浓度与农业部规定的比较(μg/kg)
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药物
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TTC法最低检出量
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农业部规定
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青霉素
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3
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4
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链霉素
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660
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200
|
|
庆大霉素
|
620
|
200
|
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卡那霉素
|
6200
|
_
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|
磺胺嘧啶
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100
|
100
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|
红霉素
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30
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40
|
|
环丙沙星
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500
|
_
|
|
土霉素
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100
|
100
|
|
金霉素
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100
|
100
|
我们用Snap法检测上述几种药物在牛奶中残留，Snap仪器仅仅对青霉素含量超过3μg /kg时报告阳性，而对其余8种药物均不敏感。这是由于本实验所用试剂盒特异性针对青霉素的缘故。
国家标准在介绍TTC法中被检牛奶加入嗜热链球菌菌液的量时，只是说将培养15小时的细菌原液1：1稀释后使用。事实上，由于受菌种活力、培养用脱脂乳营养成分等多种因素的影响，此时的菌液量已难以统一[6，7]。加入的细菌数量过多或过少均会对试验结果产生影响。因此，我们在检测时，增设了一个确定菌液稀释度的步骤，收到很好的效果，试验结果重现性好，灵敏度符合要求。另外，按照国家标准描述，在被检牛奶中加入TTC试剂培养30分钟后观察结果，若试验管呈现白色，则继续培养半个小时。我们在实验时发现，当牛奶中抗生素含量比较低时，可以在加入TTC试剂培养10至15分钟后就可以观察牛奶的颜色变化。因为有时加入TTC后培养时间过长，低含量的含抗奶颜色会和无抗奶颜色趋于一致而无法分辨出两者之间的差别。
目前，我国养殖场使用兽药尚不规范。兽药使用种类多，例如，牛场兽医在治疗奶牛乳房炎、子宫内膜炎等一些常见多发病时，除青霉素类药物外，还使用庆大霉素、磺胺类药物、土霉素等。我国牛奶收购站和牛奶公司在检测牛奶中的抗菌药物残留时，主要采用针对β－内酰胺类抗生素的Snap快速检测试剂盒。Snap法的优点是特异性高、快速、准确。但是因为我国目前的Snap试剂主要针对β－内酰胺类抗生素，对其它抗生素如庆大霉素、磺胺类药物、土霉素等常用药物均不敏感，因此在实际检测过程中难免会造成疏漏。而TTC法的检测谱较广，本试验中可以检出牛奶中的残留的青霉素、磺胺嘧啶、红霉素、土霉素和金霉素等，并且灵敏度达到农业部规定的检测要求。和Snap法比较，TTC法的成本低廉。TTC法的缺点是检测花费的时间较长，需要3～4小时才能完成对一个样品的检测，而Snap法只需要9左右分钟。因此，在实际使用时，可以根据具体情况，选择合适的检测方法。
参考文献
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3.马兆瑞，祝战斌，卡尔·莱金特.乳和乳制品中残留抗生素的检测方法[J].中国乳品工业，2003，31（4）：37～40
4.Jones，G.M. On-farm tests for drug residues in milk.ww.ext.vt.edu
5.吴瑕，张兰威.牛乳中抗生素残留及其检测方法的研究进展[J].食品与发酵工业，2004，30（7）：112～116.
6.丁洁，陈晓蔚，曾理等.牛奶中抗生素残留两种检测方法的论证和应用[J].中国卫生检验杂志，2004，14（5）：639～640
7.邓冬云，余淑冰，梁景涛等.牛奶中抗生素残留量两种测定方法的比较[J].中国卫生检验杂志，2003，13（5）：661～662
8.《无公害食品 生鲜牛乳》[S]，中华人民共和国农业部，NY 5045－2001
9.葛志荣等.《主要贸易国家和地区食品中农兽药残留限量标准》食品卷，上册[M].中国标准出版社，北京，2006年，277～286，1076～1101
10.《动物性食品中兽药最高残留限量》[S]，中华人民共和国农业部第235号公告，2002年12月24日
11.《食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留量检验》[S]，中华人民共和国国家标准，GB/T 4789.27-2003